細胞計數是確定培養中鋪板的細胞濃度、確定細胞活力和評估細胞分離程序結果的一個組成部分。建議在細胞分離之前進行初始細胞計數；然后可以將該數字與細胞分離后的細胞計數進行比較，以計算細胞恢復率。此外，當預期細胞活力可能會降低時，應進行活細胞計數，例如，在處理冷凍保存的細胞或離體操作的細胞時。本文描述了如何使用3%乙酸和亞-CH3藍進行總有核細胞計數，以及如何通過臺盼藍染料排除進行活細胞計數。
實驗步驟和方法：
I部分：樣品制備
選項1：用3%乙酸和亞-CH3藍對總有核細胞計數進行細胞稀釋
使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養基對充分混合的單細胞懸浮液進行適當稀釋。為了準確表示濃度，請使用至少20μL的細胞懸浮液進行稀釋。
示例：制備10倍稀釋液
在微量離心管或96孔板的孔中加入180μL的3%乙酸和亞-CH3藍。混合細胞懸浮液，將20μL添加到含有3%乙酸和亞-CH3藍的試管或孔中。
選項2：通過臺盼藍染料排除對活細胞計數進行細胞稀釋
確保要計數的細胞懸浮液*重新懸浮。在細胞沉降之前，將適量的細胞懸液(20-200μL)放入離心管中。加入等體積的0.4%臺盼藍并輕輕混合。將混合物在室溫(15°C–25°C)下孵育5分鐘。
II部分：使用血細胞計數器進行細胞計數
通過用70%C2H6O清潔腔室表面來制備血細胞計數器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。
使用20μL移液器重新懸浮細胞混合物，并將10μL的染色細胞放入血細胞計室。
注意：小心不要移動蓋玻片。允許毛細作用將樣品吸入。
將血細胞計數器放在雙目光學顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調整到10倍放大倍率并聚焦在細胞上。
使用手動計數計數器，計算血細胞計數器四個外部正方形中的每一個中的細胞（染色的細胞核）（圖1A），包括位于底部和左側周邊的細胞，但不包括位于頂部和右手邊（圖1B）。如果在第一部分中使用了3%乙酸和亞-CH3藍，則計算染色的細胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍，則計算未染色的活細胞。
細胞計數儀
血細胞計數器圖指示（A）四組紅色和（B）其中一組應用于計數的16個方塊。
注意：適當的稀釋系數將取決于起始樣本中存在的大致細胞數量，但應使血細胞計數器中的細胞濃度為每平方（即大或主要正方形）50-100個細胞。如果血細胞計數器上每個主要正方形的細胞多于或少于大約100個，請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。
血細胞計數器的九個主要方塊中的每一個都代表0.1mm3的總體積。由于1cm3相當于1mL，因此可以使用以下等式確定細胞濃度：
有核細胞總數/mL=每平方平均細胞數x稀釋因子x104
示例：如果四個外部方塊中的每一個的細胞計數在100稀釋因子下分別為21、15、20和17，則平均細胞計數將為(21+15+20+17)÷4=18.25。
因此，原始懸浮液中細胞的總濃度為：18.25x100x10^4=18,250,000個細胞/mL。
使用人工的細胞計數方法誤差率較高，為提高細胞計數的準確度和細胞計數效率可以使用細胞計數儀進行細胞計數。博大博聚旗下的細胞計數儀系列，具有多種規格供選擇，可以滿足不同的用戶需求。
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